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科研進(jìn)展

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西南大學(xué)實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)《Lab on a Chip》期刊最新研究發(fā)表

發(fā)布時(shí)間：2024-07-24 作者：江蘇瑞明生物科技有限公司 點(diǎn)擊次數(shù)：379次

內(nèi)容概要：


概述


西南大學(xué)余玲教授課題組在《Lab on a Chip》期刊發(fā)表最新研究成果：“Probing the interaction between metastatic breast cancer cells and osteoblasts in a thread-based breast–bone co-culture device” ，研究組基于Col-I@thread的共培養(yǎng)模型模擬骨組織微環(huán)境，揭示癌細(xì)胞與骨組織間的串?dāng)_，為探索乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞和分子機(jī)制提供了平臺，并具有高通量篩選抗乳腺癌骨轉(zhuǎn)移藥物的潛力。研究中使用江蘇瑞明生物的實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)技術(shù)在該研究中用于檢測在Col-I@thread上生長的成骨細(xì)胞MC3T3-E1與2D培養(yǎng)板上生長的細(xì)胞的Ca2+分泌活性和礦化結(jié)節(jié)，表明在Col-I@thread上生長的細(xì)胞活性和骨基質(zhì)形成更好。



背景&方案


乳腺癌對女性來說是一個(gè)潛在的巨大威脅，骨是晚期乳腺癌患者最常見的轉(zhuǎn)移部位，嚴(yán)重影響患者的生活。由于體外實(shí)驗(yàn)有限，動物模型不合適，導(dǎo)致乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者缺乏有效的治療方法。在過去的幾十年里，微流控裝置因其良好的空間分辨率和構(gòu)建細(xì)胞-細(xì)胞共培養(yǎng)室的潛力而在生物分析領(lǐng)域具有應(yīng)用價(jià)值。近年來，基于線程的微流控技術(shù)作為微流控發(fā)展的一個(gè)分支，因其在纖維間形成的毛細(xì)結(jié)構(gòu)而備受關(guān)注。


基于線程的細(xì)胞培養(yǎng)裝置的制作如下圖，(A)將凍干的Col-I@thread打結(jié)在聚氯乙烯(PVC)框架上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。(B)將兩塊thread@PVC框架堆疊起來組裝乳腺成骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型。


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要點(diǎn)解析


01

為研究I型膠原修飾尼龍線(Col-I@thread)對細(xì)胞附著和增殖的影響，研究組使用不同方法制備了I型膠原修飾尼龍線(Col-I@thread)，發(fā)現(xiàn)凍干方法制備的膠原修飾尼龍線能夠吸附更多的蛋白，圖1。同時(shí)，成骨MC3T3-E1細(xì)胞和乳腺癌4T1細(xì)胞在Col-I@thread上都有很高的粘附和增殖能力，并且相比于在2D細(xì)胞培養(yǎng)板上，絲線的三維結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞的附著和增殖，圖2。


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圖1 Col-I改性尼龍線的特征。(A) Col-I改性后尼龍線的SEM圖。(B)原始尼龍線，RT Col-I@thread和凍干Col-I@thread的C 1s的高分辨率XPS光譜。(C) BCA法定量測定尼龍線上的Col-I吸附。


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圖2.Col-I@thread上細(xì)胞的粘附和增殖。(A) MC3T3-E1細(xì)胞和4T1細(xì)胞MTT甲酸結(jié)晶紫圖像。(B) MTT增殖試驗(yàn)量化MC3T3-E1和4T1的生長。*表示p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。(C)培養(yǎng)14天后成骨細(xì)胞MC3T3-E1的骨骼染色共聚焦圖像。細(xì)胞核用DAPI核染料染色(藍(lán)色)，微絲用Actin-Tracker標(biāo)記(綠色)。


02

在Col-I@thread上生長的成骨細(xì)胞(MC3T3-E1)通過升高RUNX2、ALP、OPN和Col-I基因表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)技術(shù)在該研究中用于在Col-I@thread上生長的成骨細(xì)胞MC3T3-E1與2D培養(yǎng)板上生長的細(xì)胞的Ca2+分泌活性和礦化結(jié)節(jié)檢測，表明在Col-I@thread上生長的細(xì)胞活性和骨基質(zhì)形成更好。


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圖3 Col-I@thread和2D培養(yǎng)板上MC3T3-E1細(xì)胞的RNA-Seq分析。(A)差異表達(dá)基因火山圖。(B)豐富的KEGG通路注釋分類。Q值<0.05為顯著富集。(C)不同條件下細(xì)胞生長的Venn圖。(D) Venn圖交集基因的基因表達(dá)熱圖和KEGG通路圖。


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圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析I型膠原(Col I) (A)、骨橋蛋白(OPN) (B)、矮子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (RUNX2) (C)和堿性磷酸酶(ALP) (D)在GAPDH表達(dá)水平(作為內(nèi)控)上的表達(dá)水平(Col-I@thread和2D培養(yǎng)板)。(E)相對基因表達(dá)熱圖。(F)上下游基因信號通路。


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圖5 在Col-I@thread上生長的細(xì)胞鈣代謝增加。(A)細(xì)胞培養(yǎng)板和Col-I@thread上MC3T3-E1細(xì)胞胞內(nèi)鈣的熒光圖像。(B)納米探針檢測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的圖像。(C)單細(xì)胞多模態(tài)分析系統(tǒng)定量的鈣離子熒光強(qiáng)度(***表示p<0.001, n=10)。(D)茜素紅s染色的成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)(E)在Col-I@thread上培養(yǎng)3、7、14天的MC3T3-E1堿性磷酸酶(ALP)活性。*表示p<0.05，**p<0.01, n=5。(F)成骨細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)后抗拉強(qiáng)度試驗(yàn)。(G) MC3T3-E1支撐成骨細(xì)胞7、14、30天后Col-I@thread的力學(xué)性能。*表示p<0.05，**p<0.01, n=5。


MC3T3-E1細(xì)胞分別在凍干的Col-I@thread和Col-I@2D培養(yǎng)板（對照）上培養(yǎng)7天和14天。隨后，用鈣熒光標(biāo)記物Fluo–4 AM染色。檢測單細(xì)胞中鈣離子的熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長）。實(shí)驗(yàn)中使用實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，定位到檢測細(xì)胞，隨后操縱納米探針（100nm）緩慢地穿透細(xì)胞，定位至活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分，傳輸激發(fā)源（Ex:494nm)，通過光信號采集系統(tǒng)（Em：516nm）收集單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)采集的鈣離子的熒光信號。每個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測10個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均熒光。


03

將Col-I@threads在指間交叉指框架中打結(jié)，組裝乳腺癌-骨共培養(yǎng)模型。研究證明，基于線程的共培養(yǎng)裝置使我們能夠分離浸潤性和非浸潤性乳腺癌細(xì)胞，并比較它們的分子特征。在骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中，CX43、CXCR5和CSPG4基因的表達(dá)顯著升高。同時(shí)，RUNX2和OPG基因在成骨細(xì)胞中的表達(dá)受到抑制


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圖6 共聚焦顯微鏡圖像的成骨細(xì)胞(紅色)與乳腺癌細(xì)胞4T1(綠色)共培養(yǎng)使用線為基礎(chǔ)的設(shè)備。三維重建側(cè)視圖顯示4T1細(xì)胞侵入成骨細(xì)胞。



實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀


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1

實(shí)時(shí)單細(xì)胞多指標(biāo)檢測：實(shí)時(shí)檢測單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca2+、K+等）及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等），可匹配160余種商品化試劑盒；

2

實(shí)時(shí)亞細(xì)胞原位檢測：在亞細(xì)胞水平（胞質(zhì)、胞核、胞膜）實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)連續(xù)、原位檢測；

3

超微量提取、注射：單細(xì)胞水平提取細(xì)胞器（如溶酶體、線粒體）、胞質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜或其它平臺的聯(lián)用分析；單細(xì)胞注射藥物、代謝劑等，并進(jìn)行藥效或機(jī)制評價(jià)；

4

活體水平檢測：活體水平實(shí)時(shí)檢測生化指標(biāo)（用藥前后、中醫(yī)藥針灸刺激前后）的變化。


公司介紹
江蘇瑞明生物科技有限公司是一家集研發(fā)、生產(chǎn)、銷售精密生命科學(xué)儀器于一體的高新技術(shù)企業(yè)，也是無錫市政府重點(diǎn)引進(jìn)的海外高層次人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)企業(yè)。公司產(chǎn)品聚焦細(xì)胞領(lǐng)域，涵蓋細(xì)胞觀察、操作、分析、活體檢測及樣品前處理等多個(gè)方面，包括本文使用的實(shí)時(shí)單細(xì)胞多模態(tài)分析儀之外還有、活細(xì)胞智能監(jiān)測系統(tǒng)、顯微操作系統(tǒng)、超微量提取注射儀、油壓注射器、開放式活體動物成像儀以及超微量芯片點(diǎn)樣儀等具體產(chǎn)品。


原文鏈接


Wu SM, Chen F, Yang XY, Wu TF, Sun W, Yu L. Probing the interaction between metastatic breast cancer cells and osteoblasts in a thread-based breast-bone co-culture device. Lab Chip. 2023 Jun 13;23(12):2838-2853. doi: 10.1039/d3lc00106g.

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