湖北大學(xué)王升富、文為教授課題組在《Applied Materials & Interface》期刊發(fā)表最新研究成果：“Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA?Peptide?DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells ” ，研究組提出了一種由肽核酸-肽- DNA共聚物引導的內源性蛋白酶激活納米傳感器(PA-NS)，代替外源性引發(fā)劑在體外原位檢測低含量的癌癥生物標志物，通過(guò)實(shí)時(shí)單細胞多模態(tài)分析技術(shù)，結合電化學(xué)檢測和光學(xué)成像研究PA-NS在活腫瘤細胞中對miRNA-21 (miR-21)的光電雙模型檢測。

圖1.雙模態(tài)響應的PA-NS在單個(gè)活腫瘤細胞中腫瘤特異性檢測miR-21的示意圖

要點(diǎn)1 PA-NS對miR-21體外光學(xué)傳感的評價(jià)

圖2.(a) PA-NS雙模態(tài)檢測miR-21示意圖。(b)在CaB激活或未激活的情況下，PA-NS對不同濃度miR-21反應的熒光強度。(c) PA-NS與miR-21和CaB單獨或聯(lián)合孵育的熒光強度。(d) PA-NS檢測miR-21的邏輯運算真值表(添加和不添加miR-21或CaB分別定義為“1”和“0”)(e)不同濃度的PA-NS電化學(xué)檢測miR-21的I?V特性(插圖為I?log C的校準曲線(xiàn))

要點(diǎn)2單細胞水平上研究PANS探針的腫瘤特異性活性

研究組以腫瘤細胞為實(shí)驗組，健康細胞為對照組。如圖3b所示，利用CaB蛋白酶在腫瘤細胞中選擇性激活PA-NS系統，隨后通過(guò)與miR-21的位移反應誘導FAM熒光團的釋放。如圖3c所示，監測到活化的PA-NS探針在活腫瘤細胞中有明顯的FAM熒光響應;PA-NS探針的成功激活可歸因于腫瘤細胞中CaB蛋白酶的過(guò)表達，HeLa細胞中miR-21的高水平進(jìn)一步觸發(fā)位移反應。相比之下，由于CaB蛋白酶的低表達，PA-NS探針在健康細胞中被“鎖定”(圖3d)，表明PA-NS探針在健康細胞中不能被激活。如圖3e所示，PA-NS釋放的FAM的熒光響應幾乎可以忽略不計，這表明PA-NS具有優(yōu)異的腫瘤特異性活性，在臨床癌癥診斷和治療方面可能具有相當大的應用潛力。
      隨后，用微光纖(~ 10 μm)收集單個(gè)活腫瘤和健康細胞的熒光信號，進(jìn)一步證明了腫瘤特異性活性。首先，將PA-NS轉染到腫瘤細胞中，再孵育3.5 h，激活探針并釋放FAM熒光信號。然后，利用三軸微操作系統將微光纖精確地附著(zhù)在細胞膜上。在微光纖的輔助下，將495nm的激發(fā)光引導至單個(gè)活細胞，激活FAM熒光信號。如圖3f所示，微光纖輻照后細胞形態(tài)和細胞活力幾乎不受影響，說(shuō)明微光纖對細胞活性的影響可以忽略不計。然后用光電倍增管(PMT)收集并記錄單個(gè)活細胞的熒光信號。利用微光纖分別監測單個(gè)腫瘤細胞和健康細胞釋放的FAM信號。如圖3g所示，通過(guò)PMT獲取6個(gè)單個(gè)腫瘤細胞和健康細胞釋放的FAM熒光信號，并用微光纖進(jìn)行定量分析。我們看到腫瘤細胞釋放的熒光強度遠高于健康細胞，證實(shí)PA-NS在腫瘤細胞中可以被特異性激活，在健康細胞中處于“停止”狀態(tài)?？紤]到細胞的異質(zhì)性，從20個(gè)單個(gè)活腫瘤細胞和健康細胞中收集相應的統計結果，揭示了熒光強度的變化。如圖3h所示，在單細胞水平上，腫瘤細胞的熒光強度值比健康細胞高約3.4倍，比空白組高約5.1倍，這與熒光成像結果吻合良好。此外，健康細胞的熒光強度比空白組高~ 1.55倍，表明PA-NS具有令人滿(mǎn)意的腫瘤特異性活性和對腫瘤細胞的低背景信號。

圖3.(a)用Lip3000轉染PA-NS的過(guò)程。(b) PA-NS在腫瘤細胞中的活化過(guò)程。(d) PA-NS在健康細胞中的反應。高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示PA-NS對腫瘤細胞(HeLa細胞)(c)和健康細胞(HUVEC細胞)(e)的反應。(f)高分辨率熒光顯微鏡圖像顯示靠近細胞的微光纖:(i)無(wú)激發(fā)的亮場(chǎng);(ii)在約490 nm處激發(fā);(iii)與赫斯特病毒孵育;(四)合并圖像。(g)利用微光纖檢測PA-NS在單個(gè)活腫瘤細胞和健康細胞中的熒光響應。(h)利用微光纖，PA-NS對單個(gè)活腫瘤細胞和健康細胞的對應熒光強度(490nm)箱形圖。標尺:20 μm。

要點(diǎn)3 miR-21在單個(gè)活細胞中的原位光學(xué)定性和電化學(xué)定量分析

為了驗證在單個(gè)活細胞中同時(shí)進(jìn)行光學(xué)和電化學(xué)檢測miR-21的可行性，首先，評估了用電極插入細胞并同時(shí)用微光纖將其連接到同一細胞上的操作可行性。如圖4a所示，在雙邊三軸微操作系統的幫助下，納米電極和微光纖被引導并移動(dòng)到同一個(gè)單細胞中。用微光纖監測了單個(gè)腫瘤細胞60s內熒光強度的變化。如圖4b所示，觀(guān)察到一個(gè)“signal-on”熒光信號，熒光強度在60s內趨于穩定，說(shuō)明FAM熒光信號具有良好的穩定性和低背景信號?？紤]到細胞的異質(zhì)性，收集并測量了幾種腫瘤細胞的熒光強度。如圖4c所示，腫瘤細胞的熒光響應比空白組高~ 5倍，證明PA-NS可以在腫瘤細胞中被激活，并借助微光纖實(shí)現單細胞水平的光學(xué)分析。接下來(lái)，評估了用修飾的Au NE在單個(gè)活細胞中電化學(xué)檢測miR-21的可行性。如圖4d所示，通過(guò)三軸微操作系統控制和引導修飾后的Au NE附著(zhù)在細胞上，然后通過(guò)倒置顯微鏡上安裝的微操作器調節納米電極并插入細胞(圖4e)?？紤]到細胞的異質(zhì)性，對15個(gè)單個(gè)活腫瘤細胞收集并分析相應的統計結果。如圖4f所示，納米電極與腫瘤細胞孵育后，電化學(xué)信號下降了約40% (***P < 0.001;平均值±SD = 1.00±0.09 vs 0.62±0.09)，表明PA-NS涉及雙模型信號輸出平臺，可以檢測單個(gè)活腫瘤細胞中的miR-21。

圖4.(a)顯示插入單細胞的納米電極和用于單細胞光子數收集的光源引導的微光纖的顯微圖像。(b)微光纖采集的腫瘤細胞熒光強度。(c)使用微光纖對單個(gè)腫瘤細胞的熒光強度進(jìn)行相應的直方圖統計。納米電極在細胞外(d)和插入細胞內(e)。(f) 15個(gè)單個(gè)活腫瘤細胞對應的電流框圖。標尺:20 μm。

實(shí)時(shí)單細胞多模態(tài)分析儀 

瑞明生物實(shí)時(shí)單細胞多模態(tài)分析儀主要性能

1、實(shí)時(shí)單細胞多指標檢測：實(shí)時(shí)檢測單個(gè)活細胞內小分子含量（如葡萄糖、乳酸、ATP、膽固醇、Ca²⁺、K⁺等）及酶活性（葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、乳酸脫氫酶等），可匹配160余種商品化試劑盒；

2、實(shí)時(shí)亞細胞原位檢測：在亞細胞水平（胞質(zhì)、胞核、胞膜）實(shí)現實(shí)時(shí)連續、原位檢測；

3、超微量提取、注射：單細胞水平提取細胞器（如溶酶體、線(xiàn)粒體）、胞質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜或其它平臺的聯(lián)用分析；單細胞注射藥物、代謝劑等，并進(jìn)行藥效或機制評價(jià)；

4、活體水平檢測：活體水平實(shí)時(shí)檢測生化指標（用藥前后、中醫藥針灸刺激前后）的變化。

Endogenous Protease-Activatable Nanosensor Based on PNA–Peptide–DNA Engineering for AND-Gated and Dual-Model Detection of MicroRNA in Single Living Tumor Cells

Xiaoxue Xi, Zhen Wu, Xiuhua Zhang, Yuebin Li, Yuandi Zhao, Wei Wen, and Shengfu Wang

ACS Applied Materials & Interfaces 2023 15 (18), 21917-21928

DOI: 10.1021/acsami.3c02012